您的位置 首页 DNA/RNA技术

RNA反转录的六大要素

老话说的好,万事开头难。而这话在RT-PCR中则体现的淋漓尽致,其开头的第一步——将RNA反转为cDNA,表面上看似简单,实际上则暗潮汹涌,指不定就在哪里挖个坑,就会让斗志高昂的实验汪们摔的鼻青脸肿,而且还不知道是咋掉坑的。

显然,RNA的反转录成功,不是想有就能有。大家之所以屡败屡战、屡战屡败,就是因为忽略了以下这6个必备要素,不然此坑早就被填平,又何至于整日里看着悲催的实验结果唉声叹气呢?

1. RT Primer的最佳选择

通常RT primer可分为三类:oligo dT,随机引物以及基因特异性引物。Oligo dT引物之所以应用范围更加广泛,是因为可由此获得mRNA的全长拷贝。

然而如果mRNA长度过长>4kb,或者没有polyA尾(原核mRNA或rRNA),就需要考虑使用随机引物进行RNA的反转录。随机引物虽能确保长基因的5’末端的转录,但并不能获得整个基因全长的cDNAs,且对RNA样品质量要求比较高,此时可用6-8个核酸聚合体来提高cDNAs的合成量。

而对于真核生物的qPCR,长随机引物和Oligo-dT引物的混合物似乎能给出一个漂亮的结果。针对此类优化混合引物,已有两家公司的试剂盒或可助大家一臂之力:Qiagen QuantiTect Rev. Transcription Kit和BioRad iScript Kit。

第三个选择就是基因特异性引物,仅扩增需要的cDNA,适用于目的序列已知的情况。通常在一步RT-PCR法中可使用此类引物,因为该引物也可用作为PCR中的反向引物。

2. RNA的二级结构

若要获取全长RNA的反转录,那么RNA二级结构的问题就不可忽略,因为反转录酶在遇到此类结构后会终止反应或从模板上脱落下来。

也许你很难判断RNA是否具有二级结构,但如果基因中GC含量较高,通常意味着RNA很难被变性且不可能是单链,此时就需要在65℃ 5min对其进行充分变性,以避免其对实验结果的影响。

另外,还有一种方法可解决此问题,即使用一种最适温度高于正常标准(37℃-42℃)的逆转录酶。比如来自Life Technologies的Themoscript酶就常用于具有复杂结构RNA的逆转录。当然也存在一些即使在常规逆转录温度(37℃-42℃)的条件下,也能跨过RNA二级结构的高效率逆转录酶,即使是针对富集GC序列的RNA也能得到很好的结果,如Qiagen公司的逆转录酶Omniscript和Sensiscript,以及Takara Bio公司的PrimeScirpt RT enzyme。

3. 去除gDNA

RNA中存在的基因组DNA(gDNA)污染可能是最终PCR反应中假阳性结果出现的原因,目前已存在很多方法去除gDNA,比如通过DNAase对提取的RNA进行预处理。

以上方法无可避免会造成RNA的蛋白污染,因而这里介绍一种可绕开酶处理的方法,即针对RNA设计一种包含内含子或内含子-外显子边界的引物,如此DNA就不会产生扩增抑或即便扩增了其条带大小也与cDNA不同。

但值得注意的是,使用该方法时基因中要没有假基因存在,假基因(pseudogene)是插入到基因组中剪切mRNA的DNA拷贝,否则也会产生假阳性结果。

而对于没有内含子的原核RNA,gDNA的去除则更是基因表达准确测量的一个至关重要的因素。使用DNAase处理RNA是唯一的方法,Quantitect Rev.Transcription Kit中所包含的gDNA清除缓冲液就可在无需加热或EDTA失活的条件下降解DNA。此外,具有gDNA Eraser(Takara Bio)的PrimeScript RT试剂盒也可去除gDNA,且能在不到20分钟之内快速完成RNA的cDNA合成。

4. 检测RNA分子的完整性

毫无疑问,RNA质量对cDNA合成结果会产生重要的影响,而不同批次间RNA质量差异也导致RT-PCR产生不同的结果。所以在进行RT-PCR前,应该检查RNA条带的质量,可通过琼脂糖凝胶电泳进行检测。通常完整的真核RNA应包括28S和18S RNA条带,且较大的条带的强度应是较小条带的两倍左右,另外两个条带强度大致相同也是可以的。

而另一种准确测量RNA质量的方法是使用Agilent BioAnalzyer仪器,它可将RNA分子可视化并能在分析RNA完整数值(RNA Integrity Number,RIN)后给出一个质量的量化标准。RIN为8-10,则表示RNA质量非常好;当RIN值低于7,则说明RNA可能有降解,可能会导致一些罕见信息的丢失等问题。

5. RNA定量

除了掌握RNA的完整性之外,准确评估产量也很重要。产量的准确性会受到以下因素的影响:测量仪器的准确性、DNA的污染、盐的污染以及降解程度。而为了准确测量产量,小编我更喜欢使用Nanodrop进行UV定量。

该仪器不需要稀释样品,并且具有非常宽的测量RNA的范围。以小编的经验,它可以准确读取到10ng / ul。而传统的紫外分光光度法应避免使用大容量的比色皿,因为这需要耗费大量的样品。此法的缺点是也可在样品中测量基因组DNA,如果从RNA提取过程残留盐或酚,则会增加吸光度,使得RNA的OD值变得更高。

而解决此问题一个方法是使用荧光染料,Ribogreen是一种RNA特异性染料,可通过荧光来测量RNA产量。现在,Nanodrop已经具备检测Ribogreen所发出荧光的功能。

6. 两步法或一步法RT-PCR

RT-PCR也分两种类型:一步法(One-step PCR)和两步法(Two-steps PCR),具体操作见下图。前者,RT反应和PCR扩增是在同一个反应管中进行的;而后者,RT 反应与PCR扩增反应单独进行。

尽管这两种方法都能得到最终的结果,但是每种方法都有优缺点。选择哪种方法取决于各种因素。如下总结它们的优缺点。

一步RT-PCR消除了样品转移步骤,不仅消除了控制物污染的潜在来源,而且需要较少的准备和操作时间。又因一步RT-PCR中所使用的引物是基因特异性的,灵敏度高,常用于分析低表达水平基因。而其不足在于同一样本中只有有限数量的目的基因被扩增,且需要在转录和扩增间寻找一个平衡。

所以当时间对实验很重要时,一般采用一步法,如检测RNA病毒,也适用于高通量分析。由于该法的检测结果准确率高,因而在需要测量表达水平上的细微差异时,也可采用此方法。

而两步RT-PCR可将大批量的RNA转化为cDNA,然后储存cDNA用于后续实验,可检测大量基因;在分别优化RT和PCR步骤后,可更好地控制实验过程;又因只有少量的转录本被用于PCR,则任何可能从RNA 分离到RT反应的抑制剂(如乙醇、酚及胍盐等)都被稀释了。

但是两步RT-PCR更耗费时间,且带来污染的可能性更高;RT过程应以相同效率反转录RNA,否则会影响qPCR的启动效率,进而带来不同的实验结果,因此对于每个RT反应应使用相同的条件。

如果你需要对同一样本的多个目标进行分析时,可选择两步RT-PCR。另外,当RNA的存储是个问题时,最好是进行两步RT-PCR,因为cDNA在-20℃是稳定的。

作者: 解螺旋

解螺旋-中国临床医生的科研成长平台。医生做科研就像减肥,目的是让自己变得更好,但过程却无比痛苦。我们通过解构科研规律、归纳文章套路,授医生以渔。用最优的效率,令你成为一位懂科研的临床医生。搜索微信公众号HelixLife,关注我们吧



发表评论

您的电子邮箱地址不会被公开。

联系我们

联系我们

(44)07934433023

在线咨询: QQ交谈

邮箱: info@bioengx.org

关注微信
微信扫一扫关注我们

微信扫一扫关注我们

关注微博
返回顶部
Designed by

best down free | web phu nu so | toc dep 2017